Метод патоморфологического исследования.
Материалом для исследования являются биоптаты опухолевой ткани, которые фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина и 96° спирте. Далее удаленный материал заливается парафином, после чего выполняются тонкие, серийные срезы толщиной 5-10 мкм при помощи специальных ножей. Окраска приготовленных срезов проводится гематоксилином и эозином. При необходимости для изучения соединительной ткани проводится окраска пикрофуксином по методу Ван - Гизона, для определения состояния эластических волокон резорцин - фуксином по методу Вейгерта.
После приготовления и покраски срезов их исследуют в световом микроскопе, используя лупное увеличение в 64, 120, 200, 720 раз.
Метод иммуногистохимического исследования.
Материалом для иммуногисто- химического исследования служат резецированные участки кожи пациентов с опухолями кожи. Исследуемый материал помещают в нейтральный забуференный 10% раствор формалина (pH 7,4) и фиксируют в течение 24 часов. После дегидратации кусочки заливают в парафин по стандартной методике. На ротационном микротоме Microm HM325 с системой переноса срезов STS изготавливают серийные гистологические срезы толщиной 4 мкм, которые затем окрашивают гематоксилином и эозином по стандартной методике. Иммуногистохимические особенности ангионеогенеза, пролиферативной, апоптической активности и др. исследуют с помощью иммуногистохимической методики. Срезы помещают на покрытые адгезивом стекла Super Frost Plus (Menzel, Германия). Для «демаскирования» антигенов регидратированные срезы подвергают термической обработке в растворе Target Retrieval Solution (DAKO, Дания) с использованием микроволновой печи Samsung CE118KFR. После блокирования неспецифического связывания белков протеиновым блоком (DAKO) и эндогенной пероксидазной активности пероксидазным блоком (DAKO) наносят первичные антитела. Используются мышиные моноклональные антитела. Визуализацию первичных антител проводят с помощью высокочувствительной полимерной системы детекции DAKO Advance. В качестве субстрата для пероксидазы хрена используют DAB+ (DAKO). Препараты докрашивалют гематоксилином Майера. Далее окрашенные срезы заключают в полусинтетическую среду Permanent Mounting Medium (DAKO).
Микроскопию препаратов и морфометрические исследования проводят на микроскопе Olympus AX70 Provis (Olympus, Япония) с помощью программы анализа изображения Analysis 3.2 Pro (Soft Imaging, Германия) согласно рекомендациям производителя программного обеспечения. На панели инструментов с помощью опции Measure выбирается функция Area/Perimeter с дальнейшим измерением площади каждого сосуда (мкм) по позитивно окрашенным эндотелиальным клеткам (коричневый цвет) и определяют суммарную площадь сосудистого русла в каждом отдельном поле зрения. Измерение площади исследуемого поля зрения (мкм) выполняется с помощью вышеописанных опции и функции Measure и Area/Perimeter.